顯微影像核心實驗室

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超解析螢光顯微鏡 Leica TCS SP8 X STED 3X

 儀器外觀

 型號   Leica TCS SP8 X STED 3X

  正立顯微鏡Leica DM6 CS

 服務項目

  • 提供優異於一般共軛焦解析度的螢光影像(<100nm,視螢光樣品而定)拍攝
  • 提供一般及高速共軛焦影像應用之拍攝

 

 收費標準(NT$/hr)

使用單位

使用超解析功能

僅使用一般共軛焦

臺大醫學校區

2000

1200

臺大校內其他單位

3600

1800

校外

4800

2400

 

 

 原理說明

傳統的螢光顯微鏡,受限於阿貝理論的繞射障礙 (diffraction limitation) 使解析度始終無法突破<200nm。STimulated Emission Depletion (縮寫STED)顯微鏡技術,為一種不經運算達到超解析效果純光學技術,其精髓在於想辦法將焦點附近的螢光分子抑制不發光(stimulated emission depletion),使得發螢光的範圍變得極小,而達到超解析的效果。此技術乃利用兩道雷射:一為激發螢光之雷射,一為壓制螢光的雷射;兩者重疊整合成甜甜圈狀,中間部位為螢光放光部位,外圈被壓制的甜甜圈部分的則進行受激放光 (此部位的螢光分子無法發出螢光,由激發態S1受激向下躍至S0且產生了波長和相位與壓制雷射相同光子,這些光與發散螢光因為波長不同,兩者可以輕易分開,見下圖a),突破了繞射侷限,可產生比共軛焦影像更高的解析度,且解析度可隨depletion laser 之強度調整,理論上 depletion laser強度越強可達到越高的解析度(提升至 50 nm 以下),在實際上機時可針對不同樣本特性而調整最適參數。

 Principles underlying stimulated emission depletion (STED) microscopy. a Highly simplified Jablonski diagram illustrating the transitions in electronic state during normal fluorescence and during stimulated emission. In normal fluorescence, a molecule is excited by light of shorter wavelength and then emits light of longer wavelength whilst transitioning back to an unexcited state. Stimulated emission of the excited molecular state by an additional depletion laser causes the emitted light to be of sufficiently longer wavelength and shorter fluorescent lifetime so that it can consequently be separated from normal fluorescence. b A doughnut-shaped depletion laser (in red) effectively reduces the point spread function (PSF) of normal fluorescence (in green and marked by a double arrow) below its diffraction limit since only the unstimulated light from the centre of the doughnut is collected. The sample is scanned with this arrangement as for conventional scanning confocal microscopy  

 

 儀器規格與特色

TCS SP8 STED 3X 最新STED module 同時存在兩種光路,使得XYZ三軸之解析度可同時增加, Vortex 增加 XY 軸解析度,Z-Donut 增加 Z 軸解析度經由精密光路結合,可同時得到XYZ 軸三個象限之超解析影像。解析的效果可自由調整,可選擇100% 都經由Vortex 達到最佳XY 軸解析度,或經由 Z-Donut 得到最高Z 軸解析度。左圖為樣本使用60% Z donut & 40% Vortex 完成 91 層Z- stack掃描後3D 投影圖,不僅在 xy 平面達到超解析效果,更於xz 平面也完成超解析影像。

 

 

 

 

 

本套儀器配備有100X 油鏡和93X 甘油鏡兩種特殊設計的STED 專用物鏡,在可見光雷射和STED雷射波段都做了精密校正;其中93X 甘油鏡則有更長的工作距離,使有較厚的組織樣本也可適用。

本機搭配有405nm laser與White Light Laser 470-670nm提供最有彈性的激發光源選擇。STED壓制雷射方面有592nm, 660nm,775nm三支,最多可達到三色的超解析螢光拍攝。

 樣品上機需求

  1. 本儀器屬研究型高階分析儀器類型,委託超解析影像拍攝時需檢附委託樣品之共軛焦顯微影像或一般螢光影像做為參考。
  2. 委託者應先了解超解析顯微技術及其限制,且委託上機樣品須符合所委託技術之樣品備製需求。
  3. 請至影像核心網站下載樣品資訊調查表,填妥樣品種類、染劑或螢光蛋白光譜、實驗影像需求等資訊。
  4. 符合上述1~3項條件方可正式申請上機,進行上機時段預約。
  5. 若有相關文獻影像實驗方法與參考資料請一併檢附。
  6. 適用於本機合適的染劑與螢光蛋白請參考以下連結: http://rd.mc.ntu.edu.tw/bomrd/imgcore/upfile/downloadfile/1865103058.pdf
  7. 我們建議優先選擇使用775nm雷射做為壓制雷射的染劑/螢光蛋白,並且使用STED專用二抗以達最佳效果,可向本核心詢問STED專用二抗試用品。
  8. 樣品備製請使用#1.5H蓋玻片,可向本核心索取試用品。
  9. 封片膠請使用Mowiol, Glycerol, ProLongGold/Dimond,86% glycerol + 4% NPG (N-propyl-gallate),86% glycerol + 2.5% DABCO。 避免下列封片膠: Vectashield (Vectorlabs), Slowfade (invitrogen), Para-phenylenediamine (PPD)

 ⚡Data圖片


國立台灣大學醫學院第一共同研究室顯微影像核心實驗室

Imaging Core Facility of the First Core Laboratory, College of Medicine, National Taiwan University

管理人員: 徐華蔓 范綱祐 副技師 TEL: 02-23123456 ext 88509 E-mail: hsuhuaman@gmail.com