⚡儀器外觀

 

 

 ⚡型號   Leica TCS SP8 X STED 3X

 ⚡ 正立顯微鏡Leica DM6 CS

⚡ 儀器管理人 吳亭吟副技師

 ⚡服務項目

• 提供優異於一般共軛焦解析度的螢光影像(<100nm，視螢光樣品而定)拍攝
• 提供一般共軛焦影像或共振式掃描器高速共軛焦影像之拍攝
• 提供高速共軛焦螢光生命週期影像之拍攝

 

 

 ⚡原理說明

• STED(STimulated Emission Depletion )顯微鏡技術)

傳統的螢光顯微鏡，受限於阿貝理論的繞射障礙 (diffraction limitation) 使解析度始終無法突破<200nm。STimulated Emission Depletion (縮寫STED)顯微鏡技術，為一種不經運算達到超解析效果純光學技術，其精髓在於想辦法將焦點附近的螢光分子抑制不發光(stimulated emission depletion)，使得發螢光的範圍變得極小，而達到超解析的效果。此技術乃利用兩道雷射:一為激發螢光之雷射，一為壓制螢光的雷射；兩者重疊整合成甜甜圈狀，中間部位為螢光放光部位，外圈被壓制的甜甜圈部分的則進行受激放光 (此部位的螢光分子無法發出螢光，由激發態S1受激向下躍至S0且產生了波長和相位與壓制雷射相同光子，這些光與發散螢光因為波長不同，兩者可以輕易分開，見下圖a)，突破了繞射侷限，可產生比共軛焦影像更高的解析度，且解析度可隨depletion laser 之強度調整，理論上 depletion laser強度越強可達到越高的解析度(提升至 50 nm 以下)，在實際上機時可針對不同樣本特性而調整最適參數。

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Principles underlying stimulated emission depletion (STED) microscopy. a Highly simplified Jablonski diagram illustrating the transitions in electronic state during normal fluorescence and during stimulated emission. In normal fluorescence, a molecule is excited by light of shorter wavelength and then emits light of longer wavelength whilst transitioning back to an unexcited state. Stimulated emission of the excited molecular state by an additional depletion laser causes the emitted light to be of sufficiently longer wavelength and shorter fluorescent lifetime so that it can consequently be separated from normal fluorescence. b A doughnut-shaped depletion laser (in red) effectively reduces the point spread function (PSF) of normal fluorescence (in green and marked by a double arrow) below its diffraction limit since only the unstimulated light from the centre of the doughnut is collected. The sample is scanned with this arrangement as for conventional scanning confocal microscopy

 

 ⚡儀器規格與特色

TCS SP8 STED 3X 最新STED module 同時存在兩種光路，使得XYZ三軸之解析度可同時增加， Vortex 增加 XY 軸解析度，Z-Donut 增加 Z 軸解析度經由精密光路結合，可同時得到XYZ 軸三個象限之超解析影像。解析的效果可自由調整，可選擇100% 都經由Vortex 達到最佳XY 軸解析度，或經由 Z-Donut 得到最高Z 軸解析度。左圖為樣本使用60% Z donut & 40% Vortex 完成 91 層Z- stack掃描後3D 投影圖，不僅在 xy 平面達到超解析效果，更於xz 平面也完成超解析影像。

 

本套儀器配備有100X 油鏡和93X 甘油鏡兩種特殊設計的STED 專用物鏡，在可見光雷射和STED雷射波段都做了精密校正；其中93X 甘油鏡則有更長的工作距離，使有較厚的組織樣本也可適用。

本機搭配有405nm laser與White Light Laser 470-670nm提供最有彈性的激發光源選擇。STED壓制雷射方面有592nm, 660nm,775nm三支，最多可達到三色的超解析螢光拍攝。

 ⚡樣品上機需求

1. 本儀器屬研究型高階分析儀器類型，委託超解析影像拍攝時需檢附委託樣品之共軛焦顯微影像或一般螢光影像做為參考。
2. 委託者應先了解超解析顯微技術及其限制，且委託上機樣品須符合所委託技術之樣品備製需求。
3. 請至影像核心網站下載樣品資訊調查表，填妥樣品種類、染劑或螢光蛋白光譜、實驗影像需求等資訊。
4. 符合上述1~3項條件方可正式申請上機，進行上機時段預約。
5. 若有相關文獻影像實驗方法與參考資料請一併檢附。
6. 適用於本機合適的染劑與螢光蛋白請參考以下連結: http://rd.mc.ntu.edu.tw/bomrd/imgcore/upfile/downloadfile/1865103058.pdf
7. 我們建議優先選擇使用775nm雷射做為壓制雷射的染劑/螢光蛋白，並且使用STED專用二抗以達最佳效果，可向本核心詢問STED專用二抗試用品。
8. 樣品備製請使用#1.5H蓋玻片，可向本核心索取試用品。
9. 封片膠請使用Mowiol, Glycerol， ProLongGold/Dimond，86% glycerol + 4% NPG (N-propyl-gallate)，86% glycerol + 2.5% DABCO。 避免下列封片膠: Vectashield (Vectorlabs)， Slowfade (invitrogen)， Para-phenylenediamine (PPD)

 ⚡Data圖片

• FALCON（FAst Lifetime CONtrast, 高速螢光生命週期影像)

螢光生命週期(Fluorescence Lifetime）是指螢光發生的過程中，吸收了激發光的能量至發出螢光的這段時間，一般是在數個ns 的時間單位範圍之內。會因螢光分子的種類和環境因子而有所不同；但不會受到激發光源強度或偵測感測器的放大倍率而影響，造成測量結果的偏差，因此能提供影像中除了螢光強度之外的另一個維度的訊息。

FALCON 則是以高速的單光子計數為基礎，搭配脈衝式白光雷射和高感度感測器 HyDSMD 架構的螢光生命週期影像分析系統。FALCON 能為螢光實驗增加許多應用，包括 FLIM-FRET、FLIP、新穎螢光染料的開發、細胞生理動力學，甚至包括半導體或新型生醫材料的開發。

FALCON結合 STED superresolution 將可得到 TauSTED， 特色如下：

TauSTED 透過螢光生命週期資訊，取得來自STED過程的樣本訊號，將其與背景和雜訊中分離；
解讀螢光生命週期梯度，可以極低的STED 雷射光強度提供所需的解析度，或者將解析度推到超越傳統STED所提供的移度。

最後依樣本和螢光染劑的特性可得到清晰、高品質的影像，解析度優於30納米（橫向）和100納米（軸向）。

⚡Dtata 圖片

Cytoskeleton structures distinguished by lifetime contrast. Vimentin immunolabeled with Alexa Fluor 555 (green), and tubulin immunolabeled with Alexa Fluor 546 (blue). The fluorophores are spectrally very similar, but they are separated using the fluorescence lifetime information. Image size: 512 x 512 pixels.