首頁 基因剔除(剔入)細胞株核心實驗室注意事項

一、CRISPR打靶效率相較於TALEN技術為優，而且製備上更為快速且經濟，但是須注意脫靶效應問題。

二、設計靶點時，靶點位置盡量在基因前端，最好能破壞重要的domain和所有的轉錄產物isoform。

三、基因剔除成功與否由許多因素決定：

1. 切割區域內存在染色體複雜結構，使得所設計靶位不具有剔除活性或活性過低。
2. 欲剔除基因為必須或關鍵基因，如：細胞週期基因、細胞貼附基因等等，剔除後導致細胞死亡或生長狀況不佳，因此無法獲得同型合子細胞株。
3. 細胞轉殖效率過低，需嘗試各種轉殖方式，一般以大於百分之五十成功率較高。此時可利用報導基因做進一步篩選，如：螢光基因或抗藥基因。螢光基因表現可利用流式細胞儀進行細胞分選，而進行藥物篩檢，要先檢測出殺死細胞的最小濃度，轉殖後的細胞會較未轉殖前對藥物敏感度提高。
4. 細胞是否可以進行單一細胞群落培養也是關鍵因素，如果所選用的細胞株無法進行單一細胞株培養，則需以別的細胞株取代。
5. 欲剔除基因在細胞中存在多個基因拷貝，也會增加剔除的困難度。

四、由於細胞內存在對偶基因，一次轉殖得到對偶基因同時被破壞的機率低於只有單一股基因被破壞，若無法在第一輪篩選得到對偶基因同時被破壞的細胞株，則需進行第二輪的轉殖與篩選。

五、基因剔入實驗如果沒有進行報導基因篩選，成功率不高。細胞內發生同源重組機率一般為10^-6，有TALEN或CRISPR共轉的細胞約為0.1%~5%，僅少數例子可以高達10%，如果進行報導基因篩選或加入重組促進劑(SCR7或RS-1)則成功率可提升為10%~50%。