受illumina600cycles(2*300bp)定序試劑品質下降影響，為維持本核心16S v3v4定序的read 2 品質，原廠建議改變v3v4 primer序列，改採用offset primer策略。

如下圖所示:於v3 forward primer和v4 reverse primer外側兩端，增加heterogeneity spacer，訂購序列請參照下表，forward 8條，reverse 8條，使用時請分別把forwar reverse各8條取等量混合後，作為一對v3v4 amplification primer使用。

已與醫院第二共研協商完畢，即日起送二共進行v3v4 PCR，也將改採offset primer進行實驗。

	0-7N Offset primer seq (forward 8條，reverse 8條，共16條)
16S-v3-0F	TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG
16S-v3-1F	TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGNCCTACGGGNGGCWGCAG
16S-v3-2F	TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGNNCCTACGGGNGGCWGCAG
16S-v3-3F	TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGNNNCCTACGGGNGGCWGCAG
16S-v3-4F	TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGNNNNCCTACGGGNGGCWGCAG
16S-v3-5F	TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGNNNNNCCTACGGGNGGCWGCAG
16S-v3-6F	TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGNNNNNNCCTACGGGNGGCWGCAG
16S-v3-7F	TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGNNNNNNNCCTACGGGNGGCWGCAG
16S-v4-0R	GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC
16S-v4-1R	GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGNGACTACHVGGGTATCTAATCC
16S-v4-2R	GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGNNGACTACHVGGGTATCTAATCC
16S-v4-3R	GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGNNNGACTACHVGGGTATCTAATCC
16S-v4-4R	GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGNNNNGACTACHVGGGTATCTAATCC
16S-v4-5R	GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGNNNNNGACTACHVGGGTATCTAATCC
16S-v4-6R	GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGNNNNNNGACTACHVGGGTATCTAATCC
16S-v4-7R	GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGNNNNNNNGACTACHVGGGTATCTAATCC

(主要參考文獻: Fadrosh et al. Microbiome 2014, 2:6 http://www.microbiomejournal.com/content/2/1/6)