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16S Metagenomic Sequencing Library Preparation

1. 目前本實驗室並未提供 Stool DNA extraction相關服務，相關protocol請參考文件下載: Stool DNA extraction protocol。
2. 16S metagenomic library preparation為 2 steps PCR製備法，詳情請先參考Illumina 16S Metagenomic Sequencing Library Preparation操作手冊，依照下列步驟做到第1階段PCR結束。
3. Primer Sequence (for V3-V4 region; 若有其他特殊需求，請洽本實驗室工作同仁)
   16S Amplicon PCR Forward Primer =
   5'- TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG-3'
   16S Amplicon PCR Reverse Primer =
   5'- GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC-3'
4. PCR Condition

   	Volume		95°C for 3 minutes 25 cycles of: — 95°C for 30 seconds — 55°C for 30 seconds — 72°C for 30 seconds 72°C for 5 minutes Hold at 4°C
   Microbial DNA (5 ng/μl)	2.5 μl
   Amplicon PCR Forward Primer 1 μM	5 μl
   Amplicon PCR Reverse Primer 1 μM	5 μl
   2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix	12.5 μl
   Total	25 μl

5. 取2μl PCR Product跑膠(2%)，確定長度約為550bp，送樣時請附上電泳圖。
6. 送樣體積至少20μl。
7. **填送件單時請附上原始DNA的濃度和OD，送樣請送第1階段PCR產物**

DNA library preparation

1. Genomic DNA(gDNA)濃度需大於100ng/μl，OD260/280為1.8-2.0。
2. gDNA送樣量至少2μg以上。
3. 請附上電泳圖(1% agarose gel，標示清楚marker size)，確認無degradation。

stranded mRNA library preparation

1. Total RNA濃度需大於100ng/μl，OD260/280為1.8-2.0。
2. 送樣量至少1μg以上。

Library Quality Control

1. 製備完成之Library，上機前以Agilent 2100 Bioanalyzer (DNA 1000 Kit或High Sensitivity DNA Kit)，檢查Library size是否正確，free adapter是否有效去除。
2. 若非本實驗室製備之Library委託上機，亦須先進行Library Quality Control，確保上機品質。
3. 送樣體積至少3 μl。

Library Quantification (qPCR)

1. 製備完成之Library，上機前會利用KAPA Library Quantification Kits，定量成功接上adaptor的有效library濃度。上機所需最低濃度為4nM。
2. 若非本實驗室製備之Library委託上機，亦須先Library Quantification ，確保上機品質。
3. 送樣體積至少10μl。

MiSeq Sequencing Service 600cycle

1. 製備完成之Library，進行Library Quality Control和Library Quantification後即可以安排上機。
2. 若非本實驗室製備之Library委託上機，亦須先進行Library Quality Control 和Library Quantification ，確保上機品質。若Library QC未過，仍需上機，請簽署同意書。
3. 自製library 送樣體積至少10μl，樣本濃度需大於5nM，並附上Bioanalyzer結果。