首頁 
常見問題 Q&A常見問題 Q&A
Q. 上樣檢體需要懸浮於何種溶液中？是否可以直接懸浮於原本培養的medium中？
A.
請勿將細胞懸浮於medium中，因為medium中的 Phenol Red 會干擾螢光訊號，影響分選的結果，請於上機前將細胞懸浮於Sorting Buffer中。Sorting Buffer 的基本配方如下:
1X Phosphate Buffer Saline or HBSS (Ca++/Mg++ free)
1 mM EDTA
25 mM HEPES
調整至pH 7.0
再加入 1-2 % FBS or 0.1-0.2% BSA (Heat-inactivated), sterile filtered with 0.2um filter,
store at 4℃
若分選細胞不同，Sorting Buffer的配方可稍做調整，舉例如下:
(a) 淋巴細胞 (Lymphoid cells)：
可簡單以含1% FBS之HBSS做為Sorting Buffer，不需額外添加EDTA移除二價離子。配方中的二價陽離子可讓細胞具有更佳的活力，且由於淋巴細胞非易於群聚的細胞，即使配方中沒有EDTA也不會在分選時造成問 題。
(b) 黏著性較強的細胞 (sticky cells)：
可將Sorting Buffer配方中的EDTA含量提高到5mM，並使用經不含鈣鎂離子之PBS 透析過的FBS來配製Sorting Buffer。某些細胞在活化後會較具黏性，EDTA可抑制之。
(c) 附著型細胞 (Adherent cells)：
在製備細胞懸浮液時，細胞經 trypsin 或 accutase 去吸附處理後 (作用時間視細胞種類做調整，切記不可過度作用)，以不含二價陽離子的Sorting Buffer置換掉含Trypsin的溶液後並均勻懸浮細胞與調整細胞濃度。若需要，可提高EDTA的濃度以避免細胞重新黏聚。
(d) 含有高比例死細胞的樣本：
死細胞所釋放出來的DNA容易吸附在活細胞表面並造成細胞的黏聚。在Sorting Buffer中加入10U/mL DNAase可分解DNA。並將黏著於DNA上的細胞懸浮出來。
(參考資料來源http://facs.scripps.edu/SortLink/buffer.htm)
Q. 若欲分選獲得1x106的細胞，我一開始應準備多少細胞？
A.
假設你要的細胞只佔總數的10%，則你所需準備的細胞數如下公式: 1x106 = 10%x 50%回收率x 20x106（起始細胞數），所以你需要準備 2x107 細胞。分選速度、方式 (purity vs. yield mode) 及細胞在分選前狀況的好壞都會影響回收率。50% 回收率是把所有因素都列入考量的最低參考值。
Q. 通常做一次細胞分選需要多久時間？
A.
分選的過程有三個步驟，分別為設定分選區域、分選及分選後的分析。設定分選區域約需15-20 分鐘。分選的時間決定於細胞數目，雖然機器的分選速度最高可達70,000 細胞/sec，但為得到最佳分選結果，我們通常設定分選速度為3,000- 10,000細胞/sec。因此，如欲分選1x107細胞，其所需分選時間約為30-100分鐘。分選後約需10分鐘去分析及列印結果。所以，總共約需1-2小時去分選1x107細胞。
Q. 一批樣品可以分選出幾種細胞?
A.
FACSAria 可以從一批樣品中同時分選出一至四種不同的細胞(單向,雙向,三向或四向分選)，positive 和negative 的細胞也可以同時分選出來。
FACSJazz 則只能同時分選一或兩種細胞 (單項或雙向分選)
但兩種機型都可以進行多孔盤的分選 (6-, 12-, 24-, 48-, 96-孔盤)
相關說明請參閱 "儀器設備" 頁面
Q. 可以同時使用多少參數進行細胞分選？
A.
FACSAriaIIIu 最多可以根據十三個螢光參數去定義及分選一群細胞 (405 nm laser可偵測5種螢光訊號，488 nm laser可偵測2種螢光訊號及SSC和FSC，561 nm laser可偵測4種螢光訊號，633 nm laser可偵測2種螢光訊號)。
FACSAriaII 最多可以根據十三個螢光參數去定義及分選一群細胞 (375 nm laser可偵測2種螢光訊號，488 nm laser可偵測5種螢光訊號及SSC和FSC，561 nm laser可偵測4種螢光訊號，633 nm laser可偵測2種螢光訊號)。
FACSJazz 最多可以根據六個螢光參數去定義及分選一群細胞 (488 nm laser可偵測2種螢光訊號及SSC和FSC，561 nm laser可偵測3種螢光訊號，633 nm laser可偵測1種螢光訊號)。
Q. 分選後細胞的純度有多少？
A.
通常我們預期有95%以上的純度，如果positive的細胞佔總數的5%以上。
Q. 如果positive的細胞佔總數的1%以下，還可以做分選嗎？
A.
可以，但是低含量細胞的分選容易導致低純度及低回收率，同時也可能會增加收集的時間。
因此，我們建議使用者事先enrich 有興趣的細胞。
enrich 細胞 的方式如利用nylon wool 去除B細胞，使用 panning method 或是用magnetic beads 進行純化。
Q. 分選時可使用的收集管有哪些？可裝入多少細胞?
A.
1. 上樣區 (i) FACSJazz 僅可使用 PP 材質之 5 mL Falcon tube (BD #352053),
(ii) FACSAria 則可使用 PP 或 PS 材質之 5 mL Falcon tube。
2. 收集細胞時可使用：
(1) 15 ml 離心管 (雙向分選裝置, 收集較大量 sample / 單向或雙向分選時使用)
(2) 5 ml Falcon tube (四向分選裝置, 收集較少量 sample / 單, 雙, 三或四向分選時)
(3) 多孔盤 (6-, 12-, 24-, 48, 96-well)。
(4) 若需要, 亦可使用 1.5mL離心管進行收集 (但需把蓋子剪掉)。
以 15mL 離心管收集細胞時, 一般建議先於管內加入 7~8mL 收集液 (medium, PBS或其他溶液),
以 5mL Falcon tube 收集細胞時, 一般建議先於管內加入 2~3mL 收集液。
以 1.5mL Falcon tube 收集細胞時, 一般建議先於管內加入 700~800oL 收集液。
細胞收集管可以事先加以coating, 提高細胞存活率 (1% BSA或 10% FBS, 4℃, overnight) 。
Q. 可不可以把分選後的電子檔帶走，或進行後續分析？
A.
可以，細胞分選儀所擷取的數據可以用 PDF 形式貯存，或以 FCS 格式輸出，再以其他軟體進行分析。
Q. 細胞分選時會受到污染嗎？是否會影響到後續的培養?
A.
儀器在分選前後皆會進行清洗，但由於儀器所處環境並不保證完全無菌，故建議在細胞收集管中所裝填的 medium 內要加入抗生素，以降低污染之機率，三合一較二合一抗生素會更為穩當。
Q. R1451 細胞分選實驗空間所使用的生物材料及危險等級有何限制? 相關申請流程與注意事項?
A.
1. 本實驗空間內主要進行無菌細胞分選，研究人員必須準備無菌狀態的樣品，並有義務避免汙染本實驗空間內的儀器與其他後續使
用人員的樣品。
2. 若分選的材料為人類檢體，需檢附人體試驗委員會 (IRB) 同意進行臨床試驗證明文件。若為病人檢體，需再檢附特定病源檢測陰
性的證明 (譬如Covid19、HIV、HCV或HBV…等) 亦即樣品中不得含有感染或致病性病原體。
3. 本實驗空間並非P2~P4等級的實驗設施，不得使用RG2~4之生物材料。
4. 細胞分選服務由本核心技術員負責操作儀器，並不開放研究人員自行操作。
在開通研究人員的網路預約使用權限之前，研究人員需先與技術員確認使用的生物材料種類是否合乎法規，並討論欲使用的螢光
種類是否可被本核心的儀器順利偵測與分析。預約時，請於"細胞種類"欄中註記細胞的資料。
Q. R1453 細胞分選實驗空間所使用的生物材料及危險等級有何限制? 相關申請流程為何?
A.
1. 本實驗空間並非P2~P4等級的實驗設施，不得使用RG2~4之生物材料。
2. 若分選的材料為人類檢體，需檢附人體試驗委員會 (IRB) 同意進行臨床試驗證明文件。若為病人檢體，需再檢附特定病源檢測陰
性的證明 (譬如Covid19、HIV、HCV或HBV…等) 亦即樣品中不得含有感染或致病性病原體。若待分析的樣本已經過固定處理喪
失生物活性，方可上機進行分析。
3. 研究人員亦有義務在使用過程中，避免汙染本實驗空間內的儀器與其他後續使用人員的樣品，在使用完儀器後，必須以清潔劑與
漂白水確實進行清洗與消毒。
4. 在開通研究人員的網路預約使用權限之前，研究人員需先與技術員確認使用的生物材料種類是否合乎法規，並討論欲使用的螢光
種類是否可被本核心的儀器順利偵測與分析。並於使用完儀器後，在紀錄簿上註記所使用的生物材料來源與名稱 (如Hela、
PBMC、mouse spleen.....etc.)。
