流式細胞分析暨分選核心

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Q. 上樣檢體需要懸浮於何種溶液中?是否可以直接懸浮於原本培養的medium中?

A.

請勿將細胞懸浮於medium中,因為medium中的 Phenol Red 會干擾螢光訊號影響分選的結果,請於上機前將細胞懸浮於Sorting Buffer中。Sorting Buffer 的基本配方如下:

                                   1X Phosphate Buffer Saline or HBSS (Ca++/Mg++ free)

                                   1 mM EDTA

                                   25 mM HEPES  

                                   調整至pH 7.0

                                   再加入 1-2 % FBS or 0.1-0.2% BSA (Heat-inactivated),  sterile filtered with 0.2um filter,

                                                 store at 4℃

           若分選細胞不同,Sorting Buffer的配方可稍做調整,舉例如下:

              (a) 淋巴細胞 (Lymphoid cells)

可簡單以含1% FBSHBSS做為Sorting Buffer,不需額外添加EDTA移除二價離子。配方中的二價陽離子可讓細胞具有更佳的活力,且由於淋巴細胞非易於群聚的細胞,即使配方中沒有EDTA也不會在分選時造成問 題。

             (b) 黏著性較強的細胞 (sticky cells)

可將Sorting Buffer配方中的EDTA含量提高到5mM,並使用經不含鈣鎂離子之PBS 透析過的FBS來配製Sorting  Buffer。某些細胞在活化後會較具黏性,EDTA可抑制之。

            (c) 附著型細胞 (Adherent cells)

在製備細胞懸浮液時,細胞經 trypsin 或 accutase 去吸附處理後 (作用時間視細胞種類做調整,切記不可過度作用),以不含二價陽離子的Sorting Buffer置換掉含Trypsin的溶液後並均勻懸浮細胞與調整細胞濃度。若需要,可提高EDTA的濃度以避免細胞重新黏聚。

           (d) 含有高比例死細胞的樣本

死細胞所釋放出來的DNA容易吸附在活細胞表面並造成細胞的黏聚。在Sorting Buffer中加入10U/mL DNAase可分解DNA。並將黏著於DNA上的細胞懸浮出來。

                          (參考資料來源http://facs.scripps.edu/SortLink/buffer.htm)

Q. 若欲分選獲得1x106的細胞,我一開始應準備多少細胞?

A.

假設你要的細胞只佔總數的10%,則你所需準備的細胞數如下公式: 1x106 = 10%x 50%回收率x 20x106(起始細胞數),所以你需要準備 2x107 細胞。分選速度、方式 (purity vs. yield mode) 及細胞在分選前狀況的好壞都會影響回收率。50% 回收率是把所有因素都列入考量的最低參考值。

Q. 通常做一次細胞分選需要多久時間?

A.

分選的過程有三個步驟,分別為設定分選區域、分選及分選後的分析。設定分選區域約需15-20 分鐘。分選的時間決定於細胞數目,雖然機器的分選速度最高可達70,000 細胞/sec,但為得到最佳分選結果,我們通常設定分選速度為3,000- 10,000細胞/sec。因此,如欲分選1x107細胞,其所需分選時間約為30-100分鐘。分選後約需10分鐘去分析及列印結果。所以,總共約需1-2小時去分選1x107細胞。

Q. 一批樣品可以分選出幾種細胞?

A.

FACSAria 可以從一批樣品中同時分選出一至四種不同的細胞(單向,雙向,三向或四向分選),positive 和negative 的細胞也可以同時分選出來。

FACSJazz 則只能同時分選一或兩種細胞 (單項或雙向分選)

但兩種機型都可以進行多孔盤的分選 (6-, 12-, 24-, 48-, 96-孔盤)

相關說明請參閱  "儀器設備" 頁面

Q. 可以同時使用多少參數進行細胞分選?

A.

FACSAriaIIIu 最多可以根據十三個螢光參數去定義及分選一群細胞 (405 nm laser可偵測5種螢光訊號,488 nm laser可偵測2種螢光訊號及SSC和FSC,561 nm laser可偵測4種螢光訊號,633 nm laser可偵測2種螢光訊號)。

FACSAriaII 最多可以根據十三個螢光參數去定義及分選一群細胞 (375 nm laser可偵測2種螢光訊號,488 nm laser可偵測5種螢光訊號及SSC和FSC,561 nm laser可偵測4種螢光訊號,633 nm laser可偵測2種螢光訊號)。

FACSJazz 最多可以根據六個螢光參數去定義及分選一群細胞 (488 nm laser可偵測2種螢光訊號及SSC和FSC,561 nm laser可偵測3種螢光訊號633 nm laser可偵測1種螢光訊號)。

Q. 分選後細胞的純度有多少?

A.

通常我們預期有95%以上的純度,如果positive的細胞佔總數的5%以上。

Q. 如果positive的細胞佔總數的1%以下,還可以做分選嗎?

A.

可以,但是低含量細胞的分選容易導致低純度及低回收率,同時也可能會增加收集的時間。

因此,我們建議使用者事先enrich 有興趣的細胞。

enrich 細胞 的方式如利用nylon wool 去除B細胞,使用 panning method 或是用magnetic beads 進行純化。

Q. 分選時所使用的tube有哪些?

A.

 1.  上樣區  (i) FACSJazz 僅可使用 PP 材質之 5 mL Falcon tube (BD #352053),

                (ii) FACSAria 則可使用 PP 或 PS 材質 5 mL Falcon tube

2.  收集細胞時可使用:

     (1) 15 ml 離心管 (雙向分選裝置, 收集較大量 sample / 單向或雙向分選時使用)

     (2) 5 ml Falcon tube  (四向分選裝置, 收集較少量 sample / 單, 雙, 三或四向分選時)

     (3) 多孔盤 (6-, 12-, 24-, 48, 96-well)

     (4) 若需要, 亦可使用 1.5mL離心管進行收集 (但需把蓋子剪掉)。

以 15mL 離心管收集細胞時, 一般建議先於管內加入 7~8mL 收集液 (medium, PBS或其他溶液),

以 5mL Falcon tube 收集細胞時, 一般建議先於管內加入 2~3mL 收集液。

細胞收集管可以事先加以coating, 提高細胞存活率 (1% BSA或 10% FBS, 4, overnight) 。

 

         

Q. 可不可以把分選後的電子檔帶走,或進行後續分析?

A.

可以,細胞分選儀所擷取的數據可以用 PDF 形式貯存,或以 FCS 格式輸出,再以其他軟體進行分析。

Q. 細胞分選時會受到污染嗎?是否會影響到後續的培養?

A.

儀器在分選前後皆會進行清洗,但由於儀器所處環境並不保證完全無菌,故建議在細胞收集管中所裝填的 medium 內要加入抗生素,以降低污染之機率。


國立台灣大學醫學院第一共同研究室流式細胞分析暨分選核心

The Flow Cytometric Analyzing and Sorting Core of the First Core Laboratory, College of Medicine, National Taiwan University

管理人員:  黃志成博士 & 王靜嫻副技師   TEL: 02-23123456 ext 88356   E-mail: sorter01@ntu.edu.tw


網站更新時間:2019/9/18